IL FLUORIMETRO: storia, scienza, curiosità e molto altro su questo strumento

IL PREMIO NOBEL PER LA CHIMICA DEL 2008 Nel 2008 è stato riconosciuto e premiato con un Nobel per la chimica il lavoro degli statunitensi Osamu Shimomura (del Marine Biological Laboratory di Woods Hole e della Boston University Medical School), Martin Chalfie (della Columbia University) e Roger Y. Tsien (dell'Università della California a San Diego). Il loro merito è stato quello di isolare e studiare una particolare proteina, la GFP (Green fluorescent protein) , prodotta naturalmente da una specie di medusa bioluminescente tipica della costa occidentale del Nord America, la Aequorea victoria . Più nello specifico, Osamu Shimomura è stato il primo a isolare questa proteina e a scoprire che essa brilla di una luce verde quando è esposta a raggi ultravioletti. Martin Chalfie invece ha dimostrato l'utilizzabilità della GFP come tracciatore biologico luminoso di numerosi fenomeni biologici. Ed è proprio qui che si inserisce il fluorimetro, che usa la proteina come marcatore di al...

In questo post vedremo le operazioni base che si effettuano quando si utilizza uno spettrofluorimetro, in particolare è stato preso come riferimento il Fluorog-3 modello FL3-12 di Horiba. 1) Accendere lo strumento (tramite il pulsante apposito), il computer e il monitor di riferimento. 2) Verificare che lo strumento sia calibrato correttamente. Il primo passo è il controllo del monocromatore di eccitazione : Tramite il software installato sul computer, lanciare un esperimento senza campione e selezionando la voce " eccitazione ". Il risultato sarà un grafico: se il picco del grafico corrisponde alla massima intensità della fonte luminosa (indicata sul manuale d'uso), il monocromatore d'eccitazione è calibrato. Se i due valori non corrispondono, occorre impostare nuovamente l'esperimento. L'esperimento non va lanciato, ma va scelta l'opzione di controllo in tempo reale(CTR) . Si ripeterà il grafico precedente ma la finestra permetterà di modificare e cor...

 

Qui di seguito sono i riportati i materiali con cui solitamente vengono costruite le varie componenti del fluorimetro.   -  Sorgente luminosa : la lampada a xenon   è realizzata in quarzo fuso con due elettrodi in tungsteno alle estremità. Inizialmente utilizzata principalmente nella proiezione cinematografica, è stata poi impiegata in ambito scientifico nell'illuminazione di campioni (nel fluorimetro come in vari microscopi) perchè permette di concentrare il fascio di luce in un punto con precisione. -  Filtri ottici : sono realizzati in vetro BK7 (borosilicato), un tipo di vetro utilizzato nella realizzazione di ottiche di alta qualità, finestre, specchi, lenti, ecc. -  Monocromatore : è costituito da uno specchio curvo e un  reticolo di diffrazione (una lastra di vetro sulla cui superficie è incisa una trama di linee parallele, uguali ed equidistanti) - Filtro interferenziale (o dicroico) :  è costituito da due lastre piane e parallele di  vet...

LA FLUORESCENZA Il fluorimetro sfrutta il principio di fluorescenza, fondendo le molecole campione con marcatori fluorescenti. Le molecole del campione in esame quando vengono colpite dalla sorgente luminosa dello strumento assorbono fotoni e gli elettroni si eccitano, cioè si caricano di energia. Quest'energia rappresenta un surplus e va quindi rilasciata: e ntro poche decine di nanosecondi, la molecola libera dei fotoni, tornando al livello di partenza in due o più fasi ed  emettendo in tal modo quantità di luce a energia inferiore a quella incidente. Quest'emissione di luce è ciò che viene definito "fluorescenza": l a banda di radiazioni emesse viene detta  radiazione di Stokes o antistokes ,   a seconda che sia di lunghezza d’onda maggiore o minore della radiazione assorbita.

LE TAPPE PRINCIPALI DELL'EVOLUZIONE DELLA FLUORIMETRIA La fluorimetria è una tecnica spettrofotometrica di analisi basata sull’irradiamento di un campione con una radiazione di piccola lunghezza d’onda (ultravioletto) e sulla misura qualitativa o quantitativa della radiazione emessa dal campione. La sua storia è strettamente connessa a quella dell'osservazione della fluorescenza. - 1560/1565 :   Bernardino de Sahagún  e  Nicolás Monardes  notano  come un' infusione  chiamata lignum nephriticum  ( "legno rene") riesca a rendere l'acqua in cui viene diluita di colore azzurro opalescente, a seconda di luce e angolazione.  Il composto chimico responsabile di questa fluorescenza è la matlalina, che è il prodotto di ossidazione di una sostanza contenuta nel legno. - 1819/1822 :  Edward D. Clarke  e René Just Haüy   descrivono la fluorescenza nelle  fluoriti (minerali). - 1833 :   Sir David Brewster  osserva il fenomeno del...

LE COMPONENTI -  Sorgente luminosa : la più comune è la lampada allo xeno (emette luce col passare dell'elettricità attraverso il gas xenòn ionizzato ad alta protezione), che produce una fonte continua di radiazione. -  Filtri ottici (per il fluorimetro a filtro) : il filtro primario (o filtro d'eccitazione)   isola la lunghezza d'onda d'eccitazione per causare la fluoresceza. Il filtro secondario invece  isola la lunghezza d'onda di emissione desiderata. -  Monocromatore (per spettrofluorimetro) :  è un dispositivo ottico che trasmette una banda stretta selezionabile meccanicamente di lunghezze d'onda della luce o altra radiazione scelta da una gamma più ampia di lunghezze d'onda disponibili all'ingresso. -  Filtro interferenziale (o dicroico) : c onsente di ottenere  luce colorata  e possiede un'elevata selettività: infatti minimizza l'assorbimento di radiazione luminosa e permette il passaggio di radiazione quasi monocromatica, ovvero di u...

LE TIPOLOGIE - A filtro : è un tipo di fluorimetro che come sistema di selezione delle lunghezze d'onda ha dei filtri ottici: la selezione infatti viene fatta con uno o più filtri passa-banda, passa-alto e passa-basso e per cambiare lunghezza d'onda è necessario cambiare filtro. - Spettrofluorimetro : è un tipo di fluorimetro in grado di registrare spettri di emissione, facendo una scansione di lunghezze d'onda. Questo è possibile perché, diversamente dai fluorimetri a filtro, lo spettrofluorimetro è dotato di un sistema di selezione/dispersione delle lunghezze d'onda.